實驗方案範例
備注：紅色字體(tǐ)部分(fēn)請根據實驗實際條件修改。
版本1：針對GeneA，在Sigma網站上搜索已驗證過敲減效率的shRNA序列，合成後兩端加上酶切位點，合成雙鏈DNA oligo，成爲含幹擾序列的具對應粘性末端的shRNA表達框架。以EcorI和BamHI内切酶酶切pGP載體(tǐ)以使其線性化，形成不對稱的粘性末端。将shRNA表達框架插入pGP，轉化大(dà)腸杆菌感受态細胞，陽性克隆行PCR鑒定與測序，構建含有針對GeneA的shRNA骨架質粒。
版本2：從Genebank調取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion數據庫軟件設計針對GeneA的有效的shRNA序列，經Blast 比對進行同源性分(fēn)析後，選出特異性較高的3 組分(fēn)别命名，以可以被任意替換的莖幹發夾結構作爲陰性對照。取pGP shRNA載體(tǐ)15μL 于EP 管， 用BamHI 1.5μL 與EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反應4 h 以上；産物(wù)回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段與目的載體(tǐ)連接，連接産物(wù)加入至DH5α感受态細胞中(zhōng)轉化；用高純質粒小(xiǎo)量提取試劑盒進行質粒提取，同時挑取陽性克隆行PCR 鑒定、DNA 測序。
從Pubmed Nucleotide數據庫中(zhōng)檢索針對目的基因的CDS序列，将序列導入DNAMAN軟件中(zhōng)，進行酶切位點分(fēn)析；在該序列中(zhōng)不包含的酶切位點中(zhōng)，選擇克隆載體(tǐ)上多克隆位點中(zhōng)有的兩個限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物(wù)直接在GeneA CDS編碼區起始和末端設計，然後在引物(wù)的5’端加上相應的酶切位點。以cDNA爲模闆擴增目的基因片段，電(diàn)泳膠回收目的片段後用其兩端酶切位點處理片段并純化回收。以同樣的酶切位點處理pCDH載體(tǐ)以使其線性化，膠回收載體(tǐ)後與片段連接并轉化DH5α感受态細胞，通過PCR鑒定陽性克隆并測序。
版本1：根據突變位點特異性設計突變寡核苷酸引物(wù)并合成含突變位點且互補的兩條引物(wù)。在PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下(xià)，合成整個含有突變位點的質粒。在反應液中(zhōng)加入Dpn I 顯著性内切酶，37℃ 1 h。Dpn I 隻能切斷腺嘌呤甲基化的DNA， 能将含有甲基化的原始模闆消化，留下(xià)沒有甲基修飾的突變質粒。将反應液轉化入感受态大(dà)腸杆菌。PCR 所得的突變質粒的缺口能在大(dà)腸杆菌中(zhōng)得到修複，所獲得的菌落即含有突變質粒。
版本2：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit定點突變試劑盒構建GeneA點突變載體(tǐ)。針對需引入突變的區域設計含突變位點的引物(wù)，将質粒進行反向PCR擴增，擴增産物(wù)與DpnI混合，置于37℃恒溫反應1～2小(xiǎo)時進行消化，去(qù)除甲基化模闆質粒。配制含有Exnase的單點突變重組反應體(tǐ)系。置于37℃反應 30 min。待反應完成後，立即将反應管置于冰水浴中(zhōng)冷卻5 min。取20 μl冷卻反應液，加入到200 μl感受态細胞中(zhōng)進行轉化，随後取100 μl菌液均勻塗布在含有适當抗生(shēng)素的平闆上，長出來的陽性克隆PCR，測序鑒定。
從NCBI數據庫中(zhōng)查詢GeneA的CDS序列，在外(wài)顯子中(zhōng)确定待敲除的序列，選擇23-250bp的外(wài)顯子序列輸入軟件中(zhōng)，進行特異sgRNA設計，根據輸出的sgRNA模闆序列，合成一(yī)對序列互補的DNA Oligos。将合成的Oligos以逐步降溫的方法退貨成雙鏈，然後與Cas9質粒進行連接，轉化DH5α感受态大(dà)腸杆菌細胞，塗闆，陽性克隆測序，正确的陽性克隆，小(xiǎo)抽後獲得含shRNA表達元件的Cas9質粒。錯配酶法檢測剪切活性：靶序列PCR擴增後經變性、退火(huǒ)，将形成錯配。錯配酶（CEL1或T7E1酶）将識别錯配的雜(zá)合雙鏈并剪切。産物(wù)跑電(diàn)泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，判斷Cas/sgRNA的活性。
使用Clontech公司的Lenti-XTM HTX packaging System第四代慢(màn)病毒包裝系統。轉染前約24 hr，以4-5×106 Lenti-X 293T細胞/100 mm闆的密度接種10 ml細胞，培養過夜。按照說明書(shū)，将緻力DNA轉染體(tǐ)系和polymer體(tǐ)系分(fēn)别混勻，再将兩者混合後室溫孵育10min後滴加至293T細胞中(zhōng)，十字形搖晃混勻。4小(xiǎo)時候換液，繼續培養48小(xiǎo)時，收獲病毒上清，500g離(lí)心10min去(qù)除細胞碎片，凍存于-80℃待用。Lenti-X GoStix™檢測病毒滴度或者按照梯度稀釋法，轉染293T細胞，根據感染效率判斷滴度。
取5μg重組質粒用PacI酶切然後膠回收大(dà)片段，用TurboFect TMin vitrotransfection Rengent以2μg每孔（6孔闆）轉染融合度爲80-90%的293T細胞包裝病毒。轉染後24 h，在熒光顯微鏡下(xià)觀察綠色熒光數量與分(fēn)布情況，以跟蹤腺病毒的包裝與增殖過程；轉染6-8 d，局部出現綠色熒光葡萄串樣聚集現象；轉染10-12天，大(dà)量細胞病變變圓脫壁，出現明顯的空斑，待約50%細胞從培養容器底部脫落時收集全部培養液與細胞至離(lí)心管中(zhōng)，将細胞懸液于-80/37℃反複凍融并渦旋振蕩2次，5000g離(lí)心5 min，收集上清液，即爲第1代病毒懸液。
用第1代病毒懸液侵染融合度約90%的293Ａ細胞，2-3天後，細胞出現病變，開(kāi)始變圓脫落，待脫落50%左右，收集細胞按前述方法收集上清液，即爲第2代病毒懸液。用第2代病毒懸液再次侵染293T細胞，重複“侵染—凍融—收集”，以大(dà)量擴繁病毒和提高病毒滴度。将收集的高滴度病毒懸液用綠色熒光蛋白(bái)（GFP）标記法測定病毒滴度。
細胞預處理（以用敲減基因研究基因對細胞增殖爲例）：細胞以50000個/孔接種于6孔闆，實驗分(fēn)組：①空白(bái)對照②陰性對照③實驗組。37℃，5%CO2培養過夜後，換上OPTI-MEM培養基，同時加入根據MOI計算所需的病毒量，輕輕搖勻後繼續培養4天，期間在熒光顯微鏡下(xià)觀察綠熒光表達效率。
1）MTT實驗
消化細胞并制成單細胞懸浮液，以2000個/孔的密度于96孔闆中(zhōng)接種，每組設置5個複孔，連續檢測5天。檢測前，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT（PBS配制，pH=7.4），與37℃中(zhōng)孵育4h，小(xiǎo)心吸去(qù)上清液後，每孔加入150μlDMSO，震蕩10min，使結晶物(wù)充分(fēn)溶解。然後在酶标儀上，讀取490nm波長的吸光值。
2）CCK8實驗
使用Cell Counting Kit（CCK8）CCK-8/WST-8試劑盒：消化細胞并制成單細胞懸浮液，以2000個/孔的密度于96孔闆中(zhōng)接種，每組設置5個複孔，連續檢測5天。檢測前，每孔加入10μl CCK-8 試劑，37 ℃避光孵育2 h；然後将孵育後的培養基移到酶标闆中(zhōng)，450 nm 處用BIO-RAD 酶标儀測定的吸光度。
3）Brdu實驗
細胞以1.5×105個/ml細胞量接種于六孔闆中(zhōng)（内放(fàng)置一(yī)蓋玻片），每組設置3個複孔，培養1天，用含0.4％FBS培養液同步化3天，使絕大(dà)多數細胞處于G0期。加入BrdU（儲液：1.0 mg/ml，終濃度爲0.03 μg/ml），37℃，孵育40min。吸去(qù)上清，蓋玻片用PBS輕輕洗滌2-3次，置于甲醇中(zhōng)固定10min後在空氣中(zhōng)幹燥，0.3％H2O2-甲醇30 min滅活内源性氧化酶。随後用5％正常兔血清封閉，甲酰胺100℃，5 min變性核酸，冰浴冷卻後PBS洗滌，加1抗即抗小(xiǎo)鼠BrdU單抗（工(gōng)作濃度1：50），陰性對照加PBS或血清。按ABC法進行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下(xià)随機計數10個高倍視野中(zhōng)細胞總數及BrdU陽性細胞數，計算标記指數。
1）平闆克隆（貼壁細胞）
細胞以500個/孔的細胞量接種于六孔闆中(zhōng)，十字形手法搖勻，每組設置3個複孔，37℃，5% CO2中(zhōng)培養。每隔2天在顯微鏡下(xià)觀察克隆的大(dà)小(xiǎo)，每隔3天換上新的培養液。待大(dà)多數單克隆中(zhōng)的細胞數大(dà)于50的時候，在熒光顯微鏡下(xià)拍照。随後吸去(qù)培養液，用PBS 小(xiǎo)心洗滌一(yī)次，每孔加0.1 ml 10％甲醇溶液固定細胞30 秒鍾。吸去(qù)甲醇溶液，每孔加0.1 ml 結晶紫染液，室溫中(zhōng)放(fàng)置20 分(fēn)鍾。輕輕甩去(qù)染色液，用蒸餾水洗滌各孔，将培養闆倒置于吸水紙(zhǐ)上吸幹水分(fēn)。自然幹燥或37℃烘幹。
2）軟瓊脂集落形成（懸浮細胞）
細胞消化後制成單細胞懸液，調整細胞密度爲1000個/ml。制備底層瓊脂，完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預溫的細胞懸液以1：9比例在 40℃ 均勻混合，加入培養皿（直徑 60mm ）中(zhōng)，每皿含0.5%瓊脂培養基2ml，室溫下(xià)瓊脂完全凝固。制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200個)的細胞懸液1.5ml移入小(xiǎo)燒杯中(zhōng)，加入 40℃ 、5%瓊脂等體(tǐ)積混勻，即成0.25%半固體(tǐ)瓊脂培養基。配好的半固體(tǐ)瓊脂培養基立即加入鋪有底層瓊脂的培養皿中(zhōng)，室溫下(xià)瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養2-3周後觀察克隆形成情況。
細胞以30%的密度接種于6cm培養皿中(zhōng)，48 h 後用胰酶消化細胞，收集樣品；12,000 rpm 離(lí)心5 min，收集細胞，棄上清；用預冷的PBS 洗滌兩次，加入預冷的70%乙醇，于-20 ℃固定過夜；1,500 rpm 離(lí)心5 min，棄上清，用3 ml 的PBS 洗滌一(yī)次；加入250 μl 的100 μg/ml 碘化丙啶（propidium iodide, PI），250 μl RNase A（100μg/ml ），4 ℃避光孵育30 min；上流式細胞儀前以200 目尼龍網膜過濾細胞，以防細胞團聚堵塞流式細胞儀；采用Beckman 流式細胞儀分(fēn)析樣品，計數2-3 萬個細胞；流式細胞儀結果用細胞周期拟和軟件Flowjo 進行分(fēn)析，每組實驗獨立三次重複。
1）AnnexinV/7-AAD流式
使用凱基公司KGA1026試劑盒。用不含EDTA 的胰酶消化細胞，終止消化後，1500rpm，3min離(lí)心，吸去(qù)上清，用PBS洗1遍，離(lí)心後用PBS重懸細胞，進行細胞計數。取1E+5 個細胞量的懸液，離(lí)心棄上清，加入500 μl Binding buffer 重懸細胞。加入5 μL Annexin V-APC，混勻後，再加入5 μL 7-AAD染液，混勻，室溫，避光，反應5-15 min後置于冰上。1小(xiǎo)時内進行流式細胞儀機檢測。GFP的綠色熒光：FITC通道篩選GFP陽性細胞進行Annexin V-APC／7-AAD熒光檢測。Annexin V-APC的紅色熒光：激發波長633nm，最大(dà)發射波長660 nm。7-AAD紅色熒光：激發波長Ex=546 nm；發射波長Em=647 nm。
2）DAPI染色
培養的單層細胞 (未固定)或新鮮組織的冰凍切片等，PBS漂洗5分(fēn)鍾；DAPI工(gōng)作液（DAPI儲存液：将0.5mgDAPI溶于5ml PBS中(zhōng)，分(fēn)裝，低溫長期保存；DAPI工(gōng)作液：用PBS稀釋DAPI儲存液，終濃度爲0.1ug／ml）室溫染色5～20分(fēn)鍾(可根據實驗材料的染色結果而定)；PBS漂洗；水溶性封片劑封片，遊離(lí)細胞也可直接用含DAPI的PBS封片；最後進行熒光顯微鏡觀察：正常的細胞核呈強熒光，細胞質無熒光；固定的組織細胞同樣處理，亦可得到相似的染色結果。
1)細胞劃痕實驗
消化細胞，按照80%的密度，接種于24孔闆，每組設置三組重複。細胞培養過夜後，用預先滅菌的細竹簽或槍頭在孔的中(zhōng)部橫向劃傷一(yī)個區域，确保每一(yī)組劃傷的區域大(dà)小(xiǎo)一(yī)緻，用PBS洗去(qù)漂浮的細胞，加入新鮮培養基。每隔24 h進行一(yī)次顯微拍照，第一(yī)次拍照時作好記錄，以後每次觀察和拍照記錄同一(yī)區域細胞生(shēng)長的狀态。照片用IPP統計軟件對愈合前後的劃傷區域面積進行統計，比較不同組之間愈合的速度，以此判斷細胞的運動能力。
2）Transwell小(xiǎo)室（Corning，3422）遷移實驗/matrigel預制Transwell小(xiǎo)室（BD，354480）侵襲實驗
實驗前，實驗細胞用無血清培養基進行饑餓培養12-24h。用胰酶消化細胞，終止消化後，1500rpm離(lí)心3min，吸去(qù)上清，用PBS重懸細胞清洗細胞1遍，離(lí)心棄上清後用含0.1%BSA的無血清培養基重懸細胞，并進行細胞計數。用含0.1%BSA的無血清培養基調整細胞密度至1E+5/ml（不同細胞所需細胞密度不同）。于24孔闆中(zhōng)加入500 μL完全培養基(下(xià)室培養基血清濃度不同細胞會有所不同)；Transwell小(xiǎo)室（以下(xià)簡稱小(xiǎo)室）内部加入200 μL 細胞懸液；用鑷子将小(xiǎo)室小(xiǎo)心轉移至含有完全培養基的24孔闆孔中(zhōng)，避免出現氣泡；将24孔闆輕輕放(fàng)進細胞培養箱（5%CO2，37℃）中(zhōng)培養24h（不同細胞所需時間不同）；輕輕吸去(qù)上室培養基，用PBS潤濕後的棉簽輕輕擦去(qù)上室内的細胞；将小(xiǎo)室底面浸入10％甲醇溶液中(zhōng)固定細胞30秒鍾，轉移至純淨水中(zhōng)，把甲醇洗掉，再把小(xiǎo)室底面浸入結晶紫染液中(zhōng)染色20min，用純淨水清洗至背景清晰。鏡下(xià)随機選取5個視野，計數穿過膜細胞數。每個小(xiǎo)室中(zhōng)加入100μl 33%醋酸，将結晶紫完全洗脫下(xià)來，洗脫液在酶标儀上570nm 測其OD值。
使用碧雲天β-半乳糖苷酶染色試劑盒（C0602）進行檢測，步驟如下(xià)：預處理的細胞，按照40%的密度，接種于24孔闆。待細胞生(shēng)長3-4天後，吸去(qù)上清。用PBS洗滌1次加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15分(fēn)鍾。吸除細胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細胞3次，每次3分(fēn)鍾。吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工(gōng)作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制染色工(gōng)作液。37℃孵育過夜，可以用parafilm或保鮮膜封住6孔闆防止蒸發。普通光學顯微鏡下(xià)觀察并計數，被染成深藍(lán)色的細胞即爲衰老陽性細胞。
新鮮手術取得或凍存的組織于37 ℃ 快速複溫，原代細胞培養工(gōng)作液清洗3次，盡量修剪去(qù)除纖維組織，将組織塊剪成約1 mm3大(dà)小(xiǎo)的小(xiǎo)塊，彎頭吸管吸取組織塊均勻種植于75 cm2 培養瓶瓶底，瓶内加入少量原代細胞培養工(gōng)作液，小(xiǎo)心翻轉培養瓶使組織塊黏附于瓶底，置于37 ℃、5% CO2培養箱中(zhōng)培養6-8 h，待組織貼壁後，正置培養瓶，補加适量培養液繼續培養。每日定時觀察細胞生(shēng)長狀況，記錄細胞生(shēng)長滿瓶時間，并收集培養細胞送病理學檢查。
①酶消化法純化腫瘤細胞：當組織塊培養15-20d後，組織塊（包括無活性的腫瘤細胞、破碎細胞和成纖維細胞等）自動脫落。取出培養瓶，棄掉培養基和漂浮的組織塊，用5 mL PBS 洗滌一(yī)次。加 1.5 mL 0.25%的胰酶，前後旋轉培養瓶4-5次，使胰蛋白(bái)酶包被所有瓶内細胞，放(fàng)入37 ℃細胞培養箱中(zhōng)2 min。取出培養瓶在倒置顯微鏡下(xià)觀察，可見部分(fēn)細胞首先變圓、脫落被消化下(xià)來，這時停止消化。這些首先被消化下(xià)來的細胞爲成纖維細胞，吸除成纖維細胞及消化液。加入5 mL培養液，用吸管吹打細胞，收集細胞懸液。離(lí)心後棄上清。加入PBS 洗滌細胞沉澱，再離(lí)心棄上清，再加入培養液後接種于培養闆中(zhōng)繼續培養。
②機械刮除法純化腫瘤細胞：用不鏽鋼絲末端插橡膠刮頭或裹少許脫脂棉制成，高壓滅菌後備用。用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下(xià)生(shēng)長腫瘤細胞的部位；棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中(zhōng)，肉眼或顯微鏡下(xià)，刮除無标記空間；再用PBS沖洗1-2次，洗除被刮掉的細胞；繼續培養，如發現成纖維細胞殘留，重複刮除至完全除掉爲止。
1）流式分(fēn)選
無菌條件下(xià)收集肺癌病人手術中(zhōng)切除的肺癌腫瘤組織，用PBS緩沖液清洗組織2次，利用眼科剪去(qù)除組織中(zhōng)的壞死部分(fēn)和血管等，将腫瘤組織塊浸泡于5倍體(tǐ)積的peniclillin (1 000 U/mL)和streptomycin(1 000 U/mL)混合液中(zhōng)10 min。棄抗生(shēng)素，将腫瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織小(xiǎo)塊，然後加入5倍體(tǐ)積的胰酶消化液(0.25%胰酶含0.02% EDTA)，于37 ℃環境下(xià)震蕩消化30 min。随後，加入5倍體(tǐ)積的含10%胎牛血清的細胞完全培養基加以終止，上下(xià)颠倒震蕩使細胞脫落，過200目篩網，于1500 r/min離(lí)心5 min。收集細胞沉澱，加入100 μL預冷的PBS緩沖液，随後加入rabbit anti-human CD133-FITC monoclonal antibodies各4μL，并于4℃環境中(zhōng)避光孵育30min。利用流式細胞儀(BD FACSAria，BD Bio-science，CA，USA)将CD133+和CD133-分(fēn)選出來，并懸浮于無血清的幹細胞培養基動物(wù)實驗培養基中(zhōng)，37℃、5%CO2培養。
2）磁珠分(fēn)選
組織消化爲細胞同上，獲得的細胞用分(fēn)選緩沖液洗滌，以800 g 速度離(lí)心3 min 棄上清，将沉澱加入300μL 分(fēn)選緩沖液混勻，再加入100μL CD133 免疫磁珠，混勻後4℃避光孵育30 min，再加入緩沖液洗滌，以800 g 速度離(lí)心10 min，棄上清，再用緩沖液重懸細胞。先用500 μL緩沖液沖洗分(fēn)選柱，将細胞懸液過柱。緩沖液洗分(fēn)選柱3 次，移柱出磁場。1 mL 緩沖液洗柱，用泵加壓，收集洗液即爲CD133+細胞。
1）基因芯片/蛋白(bái)芯片
GeneA shRNA慢(màn)病毒感染細胞6天後，TRIzol裂解後吸出小(xiǎo)部分(fēn)，進行qPCR檢測，驗證敲減效率。其餘樣品凍存與-80℃後送芯片公司（***公司）進行***芯片檢測。樣品實驗分(fēn)組：陰性對照組、實驗組。
檢測結果通過标準化處理，差異篩選後，進行GO分(fēn)析、pathway分(fēn)析，篩選出GeneA敲減後，變化最大(dà)的信号通路。
1）酵母雙雜(zá)篩選目的基因相互作用蛋白(bái)（以文庫篩選爲例，也可進行一(yī)對一(yī)驗證）
通過PCR 方法擴增GeneA基因cDNA 片段，克隆進入pGBKT7 載體(tǐ)，構建pGBKT7-GeneA誘餌質粒；将被誘餌質粒轉化的AH109 分(fēn)别塗布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade 和 SD/-Trp/X-α-Gal 平闆上，以觀察誘餌蛋白(bái)是否自我(wǒ)(wǒ)激活報告基因；确認沒有自激活，就可将已被誘餌質粒轉化的AH109與預轉染于Y187 的人類肝cDNA 文庫進行酵母雙雜(zá)交，分(fēn)離(lí)陽性克隆中(zhōng)的cDNA，并測序。所得序列與數據庫進行對比，獲得與GeneA有蛋白(bái)相互結合作用的候選分(fēn)子。
2）Co-IP(以一(yī)對一(yī)驗證爲例，也可與質譜聯用進行篩選)
将欲驗證相互作用的2個分(fēn)子（A和B）分(fēn)别構建表達載體(tǐ)并共轉染293T細胞。轉染後24-48 h 後收獲細胞，加入适量細胞裂解緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4℃， 最大(dà)轉速離(lí)心30 min後取上清；取少量裂解液以備Western blot分(fēn)析，剩餘裂解液加1μg GeneA的抗體(tǐ)，4℃緩慢(màn)搖晃孵育過夜；取10μl protein A 瓊脂糖珠，用适量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離(lí)心3 min；将預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體(tǐ)孵育過夜的細胞裂解液中(zhōng)4℃緩慢(màn)搖晃孵育2-4h，使抗體(tǐ)與protein A瓊脂糖珠偶連；免疫沉澱反應後，在4℃ 以3,000 rpm 速度離(lí)心3 min，将瓊脂糖珠離(lí)心至管底；将上清小(xiǎo)心吸去(qù)，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最後加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分(fēn)鍾，分(fēn)别用A和B的抗體(tǐ)進行Western Blot檢測。
3）GST-pulldown
方案1：已知(zhī)目的GeneA，欲尋找A549細胞中(zhōng)與GeneA有相互結合作用的未知(zhī)蛋白(bái)（GST-pulldown結合質譜技術）
構建GeneA的帶GST标簽表達載體(tǐ)，轉染至293T，48小(xiǎo)時後收集細胞，裂解、蛋白(bái)定量。A549細胞蛋白(bái)裂解液用GST-谷胱甘肽瓊脂糖珠子于4℃孵育2h，以去(qù)除非特異性結合蛋白(bái)，孵育後于4℃，800g離(lí)心5 min後取上清。根據293T蛋白(bái)濃度，加入過量GST-谷胱甘肽瓊脂糖珠子以及預處理後的A549蛋白(bái)裂解液，于4℃孵育過夜。離(lí)心5 min收集沉澱并用1 XPBS（含0. 5% TritonX-100）洗滌。沉澱加入2X 電(diàn)泳上樣緩沖液于沸水浴10 min裂解，10%分(fēn)離(lí)膠的SDS-PAGE分(fēn)離(lí)，考馬氏亮藍(lán)染色顯示蛋白(bái)質條帶。
切取蛋白(bái)質條帶進行酶解。蛋白(bái)質條帶用雙蒸水沖洗2次，加入100ul新配制的脫色工(gōng)作液(50%乙腈，25mmol/L NH4HCO3)，37℃水浴30min，直至蛋白(bái)質條帶呈無色透明。加50%乙腈脫水直至膠塊完全變白(bái)後再進行還原烷基化，即加入80ul 10mmol/L DTT，57℃水浴1h，吸去(qù)多餘的DTT後加80μL6mmol/L IAA置于暗處反應45min。25mmol/L NH4HCO3吸脹并加50%乙腈脫水，最後置于真空幹燥器中(zhōng)冷凍幹燥。加入胰蛋白(bái)酶酶解16h，吸出含肽片段的上清後在膠塊上加40ul萃取液(100%乙腈，5%TFA)，超聲輔助提取兩次，合并萃取液和吸出的上清液體(tǐ)後冷凍離(lí)心幹燥。凍幹後的樣品用35L樣品溶解液（0.1%甲酸，50%乙腈）溶解，12000g，12min離(lí)心，取上清用德國Bruker公司的HCT儀器進行質譜分(fēn)析。
質譜數據分(fēn)析主要采用本地化的Mascot程序，使用MatrixScience網站（http://www.matrixscience.com）提供的IPI_rat_3.26RAT_v3.26進行檢索。檢索時，可接受的肽段相對分(fēn)子質量誤差爲0.6。氨基酸固定修飾方式選Carbamidomethyl(C)修飾，可能的修飾方式選Oxidation(M)修飾。本地運行的Mascot數據庫查詢結果的有效值爲39分(fēn)以上。
方案2：已知(zhī)目的GeneA和GeneB，驗證A和B是否有相互結合作用（GST-pulldown）
分(fēn)别構建GeneA的帶GST标簽，GeneB帶His标簽表達載體(tǐ)，将這兩個載體(tǐ)共轉染入293細胞，48小(xiǎo)時後收集細胞，裂解。取50-70ul GST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中(zhōng)，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一(yī)次，将293細胞裂解液與之混勻，4℃孵育1小(xiǎo)時，離(lí)心收集沉澱，用PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白(bái)，煮沸3分(fēn)鍾，高速離(lí)心，然後分(fēn)别用GST和His抗體(tǐ)進行Western Blot檢測，以裂解液和GST空載體(tǐ)分(fēn)别作爲陽性、陰性對照。
将GeneA表達載體(tǐ)轉染293T樣品（10cm培養皿），加入37%甲醛（終濃度爲1%），37℃孵育10min後加入甘氨酸終止交聯。吸去(qù)培養基，PBS洗滌2遍，用細胞刮将細胞收集于15 ml離(lí)心管中(zhōng)，預冷後離(lí)心去(qù)上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer，超聲破碎，離(lí)心取上清300μl（其他凍存于-80℃），分(fēn)成3組：100ul加GeneA抗體(tǐ)作爲實驗組；100ul不加抗體(tǐ)做爲對照組；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl終濃度爲0.2M）；65℃處理3小(xiǎo)時解交聯，跑電(diàn)泳，檢測超聲破碎效果。加入900 ul CHIP Dilution Buffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠轉混勻1小(xiǎo)時，4℃靜置10分(fēn)鍾沉澱，700rpm離(lí)心1分(fēn)鍾。取上清。各留取20ul作爲Input。一(yī)管中(zhōng)加入1ul抗體(tǐ)，另一(yī)管中(zhōng)則不加抗體(tǐ)。4℃颠轉過夜。加入60ul Protein A Agrose/Salmon Sperm DNA。4℃颠轉2小(xiǎo)時。4℃靜置10分(fēn)鍾後，700rpm 離(lí)心1 分(fēn)鍾。除去(qù)上清。緩沖液清洗沉澱複合物(wù)後進行洗脫。管中(zhōng)加入20ul 5M NaCl，混勻，65℃解交聯過夜。解交聯結束後，每管加入1ul RNaseA (MBI)，37℃孵育1小(xiǎo)時。每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl(pH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白(bái)酶K。45℃處理2小(xiǎo)時。DNA片段的回收——omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100 ul ddH2O。設計引物(wù)進行PCR鑒定。
将GeneA表達載體(tǐ)轉染293T樣品，消化細胞，離(lí)心去(qù)上清。加入polysome lysis buffer進行裂解。凍融後離(lí)心，上清轉移至新的EP管中(zhōng)。Sigma beads置于1.5mlEP管中(zhōng)，EP管置于磁力架上，吸去(qù)上清，加入封閉液進行封閉3h，去(qù)掉封閉液後，加入IP solusion重懸beads，平分(fēn)至2個EP管中(zhōng)，分(fēn)别加入細胞裂解上清。置于磁力架上10數秒後，吸出一(yī)點上清作爲input mRNA，加入TRIzol置于室溫。其餘含beads的IP solution置于4℃混合儀翻轉4h，然後将EP管置于磁力架上10數秒後，吸去(qù)全部上清，并用緩沖液洗beads4-5次後，加入TRIzol，這部分(fēn)爲output。将input和output兩部分(fēn)樣品用氯仿抽提RNA，反轉錄後，設計引物(wù)進行PCR鑒定。
細胞準備：GeneA敲減慢(màn)病毒感染細胞擴增至需要的細胞量。分(fēn)組，陰性對照組，實驗組。
訂購裸鼠（上海斯萊克實驗動物(wù)有限公司，Balb/c裸鼠，雄性，6周齡。每組10隻），适應一(yī)周後進行注射：細胞消化離(lí)心後制成單細胞懸液，計數後取适量的細胞用PBS懸浮，在Balb/c裸鼠側腹部皮下(xià)接種。每隻接種2E+6個細胞，注射體(tǐ)積爲100μL。此後，每隔5天測量注射部位腫瘤的體(tǐ)積。30天後裸鼠小(xiǎo)鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，80mg/kg，待小(xiǎo)鼠麻醉後置藍(lán)色背景布上拍照（側卧位，接種部位朝上），小(xiǎo)鼠頸椎脫臼處死，取出腫瘤稱重，将腫瘤置藍(lán)色背景布上拍照，腫瘤一(yī)分(fēn)爲二，一(yī)分(fēn)4%多聚甲醛固定，待後續病理分(fēn)析，一(yī)分(fēn)-80℃凍存。
對于轉移模型，還需要打開(kāi)腹腔，統計轉移竈結節數量，并置藍(lán)色背景布上拍照。将轉移竈一(yī)分(fēn)爲二，一(yī)分(fēn)4%多聚甲醛固定，待後續病理分(fēn)析，一(yī)分(fēn)-80℃凍存。
4%多聚甲醛固定後續用石蠟包埋，制成石蠟切片，用于免疫組化。-80℃凍存樣品進行總蛋白(bái)抽提，用于Western Blot檢測。
收集臨床病理樣本：收集臨床病理和随訪資(zī)料齊全的200例***癌症患者樣本，分(fēn)組根據不同TMN分(fēn)期。一(yī)部分(fēn)組織制作石蠟塊用于組織微陣列芯片檢測；另一(yī)部分(fēn)新鮮組織用于總RNA抽提，并反轉錄爲cDNA。
通過免疫組化檢測GeneA在***癌組織芯片中(zhōng)的表達情況：根據臨床病理資(zī)料和治療、預後數據，分(fēn)析GeneA的表達與腫瘤的臨床症狀（包括藥物(wù)緩解率（response rate, RR），疾病控制率(disease control rate, DCR)，無進展生(shēng)存期（progression-free survival, PFS）和總生(shēng)存期（overall survival, OS））及其他臨床病理特征之間的相關性。使用SPSS 17.0軟件進行數據統計分(fēn)析。
反轉錄獲得的cDNA，進行real-time PCR 檢測：确定組織樣本中(zhōng)GeneA以及其他下(xià)遊分(fēn)子的mRNA表達水平。結合臨床病理資(zī)料，分(fēn)析GeneA在不同惡性程度的***腫瘤中(zhōng)表達差異，同時驗證其通路機制中(zhōng)的相關分(fēn)子。
微環DNA表達雙靶向抗體(tǐ)的癌症免疫治療技術成爲繼CAR-T技術(“嵌合抗原受體(tǐ)T細胞免疫療法”)、TIL技術(“腫瘤滲潤淋巴細胞技術)、免疫檢查點抑制劑等技術之後又(yòu)一(yī)項獲得成功的新一(yī)代治療技術。
