實驗方法總結（1）：基因操作工(gōng)具
1、基因A（GeneA）的敲減載體(tǐ)構建
2、GeneA過表達載體(tǐ)構建
3、GeneA點突變載體(tǐ)構建
4、GeneA敲除載體(tǐ)構建（CRISPR/Cas9法）
5、GeneA敲除載體(tǐ)構建（TALENs 法）
6、GeneA的miRNA載體(tǐ)表達構建
版本1：針對GeneA，在Sigma網站上搜索已驗證過敲減效率的shRNA序列，合成後兩端加上酶切位點，合成雙鏈DNA oligo，成爲含幹擾序列的具對應粘性末端的shRNA表達框架。以EcorI和BamHI内切酶酶切pEGFP載體(tǐ)以使其線性化，形成不對稱的粘性末端。将shRNA表達框架插入pGP，轉化大(dà)腸杆菌感受态細胞，陽性克隆行PCR鑒定與測序，構建含有針對GeneA的shRNA骨架質粒。
版本2：從Genebank調取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion數據庫軟件設計針對GeneA的有效的shRNA序列，經Blast 比對進行同源性分(fēn)析後，選出特異性較高的3 組分(fēn)别命名，以可以被任意替換的莖幹發夾結構作爲陰性對照。取pEGFP shRNA載體(tǐ)15μL 于EP 管， 用BamHI 1.5μL 與EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反應4 h 以上；産物(wù)回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段與目的載體(tǐ)連接，連接産物(wù)加入至DH5α感受态細胞中(zhōng)轉化；用高純質粒小(xiǎo)量提取試劑盒進行質粒提取，同時挑取陽性克隆行PCR 鑒定、DNA 測序。
從Pubmed Nucleotide數據庫中(zhōng)檢索針對目的基因的CDS序列，将序列導入DNAMAN軟件中(zhōng)，進行酶切位點分(fēn)析；在該序列中(zhōng)不包含的酶切位點中(zhōng)，選擇克隆載體(tǐ)上多克隆位點中(zhōng)有的兩個限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物(wù)直接在GeneA CDS編碼區起始和末端設計，然後在引物(wù)的5’端加上相應的酶切位點。以cDNA爲模闆擴增目的基因片段，電(diàn)泳膠回收目的片段後用其兩端酶切位點處理片段并純化回收。以同樣的酶切位點處理pCDH載體(tǐ)以使其線性化，膠回收載體(tǐ)後與片段連接并轉化DH5α感受态細胞，通過PCR鑒定陽性克隆并測序。
版本1：根據突變位點特異性設計突變寡核苷酸引物(wù)并合成含突變位點且互補的兩條引物(wù)。在PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下(xià)，合成整個含有突變位點的質粒。在反應液中(zhōng)加入Dpn I 顯著性内切酶，37℃ 1 h。Dpn I 隻能切斷腺嘌呤甲基化的DNA， 能将含有甲基化的原始模闆消化，留下(xià)沒有甲基修飾的突變質粒。将反應液轉化入感受态大(dà)腸杆菌。PCR 所得的突變質粒的缺口能在大(dà)腸杆菌中(zhōng)得到修複，所獲得的菌落即含有突變質粒。
版本2：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit定點突變試劑盒構建GeneA點突變載體(tǐ)。針對需引入突變的區域設計含突變位點的引物(wù)，将質粒進行反向PCR擴增，擴增産物(wù)與DpnI混合，置于37℃恒溫反應1～2小(xiǎo)時進行消化，去(qù)除甲基化模闆質粒。配制含有Exnase的單點突變重組反應體(tǐ)系。置于37℃反應 30 min。待反應完成後，立即将反應管置于冰水浴中(zhōng)冷卻5 min。取20 μl冷卻反應液，加入到200 μl感受态細胞中(zhōng)進行轉化，随後取100 μl菌液均勻塗布在含有适當抗生(shēng)素的平闆上，長出來的陽性克隆PCR，測序鑒定。
從NCBI數據庫中(zhōng)查詢GeneA的CDS序列，在外(wài)顯子中(zhōng)确定待敲除的序列，選擇23-250bp的外(wài)顯子序列輸入軟件中(zhōng)，進行特異sgRNA設計，根據輸出的sgRNA模闆序列，合成一(yī)對序列互補的DNA Oligos。将合成的Oligos以逐步降溫的方法退貨成雙鏈，然後與Cas9質粒進行連接，轉化DH5α感受态大(dà)腸杆菌細胞，塗闆，陽性克隆測序，正确的陽性克隆，小(xiǎo)抽後獲得含shRNA表達元件的Cas9質粒。錯配酶法檢測剪切活性：靶序列PCR擴增後經變性、退火(huǒ)，将形成錯配。錯配酶（CEL1或T7E1酶）将識别錯配的雜(zá)合雙鏈并剪切。産物(wù)跑電(diàn)泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，判斷Cas/sgRNA的活性。
TAL效應因子（TAL effector, TALE）具有序列特異性結合能力，通過将FokI核酸酶與一(yī)段人造TALE連接起來，形成了一(yī)類具有特異性基因組編輯功能的強大(dà)工(gōng)具，即TALEN。利用 TALEN 技術實現基因組定點修飾的流程包括以下(xià)幾個步驟。第一(yī)步，從選定的目标序列中(zhōng)尋找合适的 TALE 候選靶位點，選擇的 DNA 序列 5' 端第一(yī)個堿基最好爲 T。爲了能快速獲得合适的 TALE 候選靶位點，目前已經建立了多個在線軟件：(1) https://boglab.plp.iastate.edu；(2)http://idtale.kaust.edu.sa；(3) http://zifit.partners.org/ZiFiT ;（4）http://bloglabx.plp.iastae.edu/TALENT/help.php。
第二步， 獲取針對 靶 序 列 的 特 異TALE 蛋白(bái)。這一(yī)步是 TALEN 技術最爲重要和複雜(zá)的一(yī)步，目前已經有多篇文章報道了改進後的獲取 TALEN 的方法 [18-22]。第三步，選擇合适的 FokI結構域，利用分(fēn)子生(shēng)物(wù)學的方法把 TALE 和 FokI組裝在一(yī)起構建完整的 TALEN 蛋白(bái)。第四步，将完整的 TALEN 引入細胞進行基因組定點修飾操作。第五步，篩選陽性克隆，評價效果。以上并不是每個 TALEN 必經的步驟，有的會在第三步與第四步之間加入酵母雙雜(zá)交等評估，首先确定其活性，然後再用于實驗。
實驗方法：
根 據TALEN 靶點選擇的原則和文獻的報道，針對 GeneA的第一(yī)外(wài)顯子設計了一(yī)對靶點。先要分(fēn)别構建出識别左、右半位點的 TALE重複序列載體(tǐ)，再與 pCS2 載體(tǐ)連接，形成最終的表達載體(tǐ)。将 TALE基本單元模塊載體(tǐ)質粒轉化至感受态細胞 TOP 菌種中(zhōng);大(dà)量搖活含有質粒的大(dà)腸杆菌後，采用天根的質粒小(xiǎo)提試劑盒提取質粒;将質粒經酶切後( SpeI、Nhe I、Hind III)進行回收、轉化、連接反應，通過菌液 PCＲ 篩選出連接成功的質粒後，進入下(xià)一(yī)輪反應;經過幾輪酶切、切膠回收及連接反應，直至完成所需要的兩側半位點的 TALE 重複序列，其中(zhōng)每輪的連接後都需要進行測序确認;再将 TALE 重複序列與 pCS2 載體(tǐ)連接，構建出最終的 pCS2-TALEN 表達載體(tǐ)質粒，酶切檢測片段連接情況後，采用 SP6 測序确認。
從 GenBank數據庫上搜索獲得 GeneA基因的mRNA序列。從 網站 www．invitrogen.com/mai獲取工(gōng)具用來設計 miRNA。選擇 GeneA基 因 mRNA序列中(zhōng)21nt片段爲合适miRNA靶序列。結合線性化pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體(tǐ)(Invitrogen公司)的特點，設計4個64nt的pre-miRNA寡核苷酸序列，該序列針對 GeneA基因不同區域，并且得到寡核苷酸序列互補的序列，經NCBI Blast的相似性搜索，排除其非特異同源性部分(fēn)。其結構爲 5’-TGC TG overhang + G + antisense target sequence+ miRNA loop + Sense target sequence-3’。将4對合成好的oligo進行退火(huǒ)。将退火(huǒ)的4條雙鏈oligo用T4DNA連接酶與酶切後的線性載體(tǐ)連接。取連接反應物(wù)轉化 DH5α菌株，挑選陽性克隆質粒，PCR鑒定與培養。利用小(xiǎo)量提取試劑盒小(xiǎo)提質粒，經 PCR擴增後進行瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，取陽性克隆菌液送公司測序鑒定。
備注：紅色字體(tǐ)部分(fēn)請根據實驗實際條件修改。
微環DNA表達雙靶向抗體(tǐ)的癌症免疫治療技術成爲繼CAR-T技術(“嵌合抗原受體(tǐ)T細胞免疫療法”)、TIL技術(“腫瘤滲潤淋巴細胞技術)、免疫檢查點抑制劑等技術之後又(yòu)一(yī)項獲得成功的新一(yī)代治療技術。
