實驗方法總結（4）：組織水平部分(fēn)

1、免疫組化... 1

1.1 SP法... 1

1.2 雙層夾心ELISA法... 1

1.3膠體(tǐ)金法... 2

2、HE染色... 3

3、原位雜(zá)交... 3

1、免疫組化

1.1 SP法

單克隆抗體(tǐ)MMP-2、MMP-9,SP試劑盒購自ZYMED公司(1 100)。3%H₂O₂封閉内源性過氧化物(wù)酶,微波加熱抗原修複, 10%正常羊血清孵育,滴加一(yī)抗, 4℃冰箱中(zhōng)過夜, PBS緩沖液(Na₂HPO₄ 8.1 mmol/L,KH₂PO₄1.5 mmol/L,NaCl 137mmol/L, 2.7 mmol/L pH 7.4)振蕩清洗後分(fēn)别滴加二、三抗,DAB顯色,蘇木素複染,常規封片。

1.2 雙層夾心ELISA法

    以純化後的多克隆抗體(tǐ)作爲捕獲抗體(tǐ)，以本實驗室已經制備的抗LM Internalin A 單克隆抗體(tǐ)3R6爲檢測抗體(tǐ)，建立雙抗夾心ELISA 方法。具體(tǐ)步驟如下(xià)：多克隆抗體(tǐ)稀釋液 →洗闆3次→3% BSA封閉 →洗闆3次→待測菌稀釋液 →洗闆3次→單克隆抗體(tǐ)稀釋液 →洗闆4次→酶标羊抗鼠IgG →洗闆5次→TMB顯色液 → 終止液→測定OD450值抗體(tǐ)、抗原和BSA 稀釋液均爲0.01mol/L、pH7.4PBS。洗闆液爲含 0.1% Tween-20 的 0.01 mol/L、pH7.4PBS(PBST)。結果判定：以(測定孔 OD 值－空白(bái)對照孔OD 值)/(陰性對照孔 OD 值－空白(bái)對照孔 OD 值)≥ 2.1(即P/N ≥ 2.1)時判斷爲陽性。

1.3膠體(tǐ)金法

    ① 器皿洗滌準備,将錐形瓶等實驗所用的玻璃器皿放(fàng)入由重鉻酸鉀和濃硫酸配制的酸液中(zhōng)浸泡 48 h，取出後用蒸餾水反複沖洗，并用超純水漂洗 3~4 次，烘幹待用。②膠體(tǐ)金的制備 膠體(tǐ)金熬制方法參照文獻 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體(tǐ)金，具體(tǐ)方法步驟如下(xià)：在含有 99 mL 超純水的幹淨錐形瓶中(zhōng)加入 1 mL 1%氯金酸溶液，配制成 100 mL 0.01%氯金酸溶液；用恒溫電(diàn)磁力攪拌器不斷攪拌加熱沸騰；氯金酸溶液煮沸後快速加入 1%檸檬酸三鈉并不斷攪拌，溶液顔色變成紫紅色後，繼續回流 10 min 後停止加熱，冷卻至室溫，存放(fàng) 4 ℃冰箱備用。③膠體(tǐ)金标記抗克倫特羅單克隆抗體(tǐ) 膠體(tǐ)金标記抗體(tǐ)制備金标抗體(tǐ)探針的方法參照文獻進行：取适量熬制好的膠體(tǐ)金溶液至燒杯中(zhōng)，用 0.2 mol/L K₂CO₃溶液調節膠體(tǐ)金溶液 pH 至6.0，超純水溶解抗體(tǐ)至膠體(tǐ)金 1/10 體(tǐ)積，并逐滴加入膠體(tǐ)金溶液，攪拌反應 30 min（抗體(tǐ)标記濃度分(fēn)别爲 0.5 μg/mL、1 μg/mL 以及 2 μg/mL），然後按膠體(tǐ)金 1/10 體(tǐ)積逐滴加入 10% BSA，攪拌封閉 30 min，繼續按膠體(tǐ)金 1/10體(tǐ)積逐滴加入 1% PEG 20000，攪拌封閉 30 min 後，9000 rpm 離(lí)心 30 min，吸去(qù)上清後加入原體(tǐ)積 1/10 的複溶液（含 1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG20000、0.1% NaN₃的 pH 7.4 0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液）重懸金标抗體(tǐ)。④CLE 膠體(tǐ)金試紙(zhǐ)條免疫反應動力學分(fēn)析  在陰性混合豬尿中(zhōng)添加 CLE 标準品至濃度分(fēn)别爲 0、0.2、0.5、1.0 ng/ml,分(fēn)别取 70 μl加入試紙(zhǐ)條加樣孔，膠體(tǐ)金讀數儀每隔 30S 測定試紙(zhǐ)條 T、C線值以及 T/C 比值，跟蹤記錄加樣後 30 min。并以 T、C 線值以及 T/C 比值爲縱坐标，時間爲橫坐标，繪制動力學曲線，觀察試紙(zhǐ)條 T、C 線值，T/C比值随濃度和時間的變化。以動力學曲線變化間接反應試紙(zhǐ)條 T、C 線上抗原抗體(tǐ)免疫學反應。

2、HE染色

1.脫蠟：①二甲苯Ⅰ脫蠟10min 左右（自動染色機染10min）；②二甲苯ⅡⅢ脫蠟5min 左右（自動染色機染10min）；③無水酒精（乙醇）Ⅰ洗去(qù)二甲苯1min（機染1min）；④無水酒精（乙醇）Ⅱ洗去(qù)二甲苯1min（機染1min）；⑤95%酒精1min（機染1min）；⑥85%酒精1min（機染1min）；⑦自來水洗片刻（機染1min）。2.染色：①蘇木素染色1～5min 左右（機染1～5min）；②自來水洗片刻（機染1min）；③1%或0.5%或0.25%鹽酸水分(fēn)化3～5s（機分(fēn)化30s）；④自來水洗，溫水藍(lán)化片刻（機洗5min）；⑤伊紅酒精染液浸染20s～2min（機染30s～5min）。3. 脫水、透明、封固：①85%的酒精脫水20s（機染20s）；②95%的酒精1min（機染1min）；③無水酒精Ⅰ染1～2min（機染2min）；④無水酒精Ⅱ染2min（機染2min）；⑤二甲苯Ⅰ浸2min（機染2min）；⑥二甲苯Ⅱ浸2min（機染2min）；⑦中(zhōng)性樹(shù)膠或加拿大(dà)樹(shù)膠封片。

3、原位雜(zá)交

鎖核酸探針熒光原位雜(zá)交（Fluorescence In situ hybridization, FISH）及免疫熒光雙标于同一(yī)切片行 miR-129-5p 和Ⅰ型膠原及整合素 α1 的雙标染色冰凍切片充分(fēn)幹燥後 DEPC-PBS 潤洗 ，0.3%的 TritonX100 浸泡 10 分(fēn)鍾， 20μg/ml 蛋白(bái)酶 k 消化 5 分(fēn)鍾，DEPC-PBS 漂洗 2 次，每次 5 分(fēn)鍾，加入雜(zá)交液（由 SSC、blocking reagent、Formamide、NLS、SDS 構成）與 60℃預雜(zá)交 1 小(xiǎo)時，加入 miR-129-5p LNA 探針（20nM），83 度變性 5 分(fēn)鍾，53℃孵育 20 小(xiǎo)時，預熱至 60℃的 Wash Buffer（由 SSC、Formamide、NLS 構成）沖洗 2 遍，遍20 分(fēn)鍾，RNase buffer 室溫孵育 5 分(fēn)鍾，含 20μg/mlRNsae A 的 RNase buffer37℃孵育半小(xiǎo)時，2×SSC 0.1%NLS 37℃ 20 分(fēn)鍾 2 次，0.2×SSC 0.1%NLS 37℃ 20 分(fēn)鍾 2 次，TBS（由 Blocking reagent、Tris-HCl、NaCl溶液構成）室溫孵育 1 小(xiǎo)時，加入 POD-DIG 及免疫熒光用的一(yī)抗（Ⅰ型膠原或整合素α1）室溫過夜，TS9.5（Tris-HCl、NaCl、MgCl₂構成）室溫潤洗 2 次，每次 10 分(fēn)鍾，TSA(TM) Biotin System 處理 30min，加入 Alexa 488 标記的羊抗兔 IgG 及 cy3-avidin 室溫避光孵育 4 小(xiǎo)時，DAPI 襯染，TNT 溶液室溫潤洗 3 遍，每遍 5 分(fēn)鍾，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。