實驗方法總結（2）：細胞生(shēng)物(wù)學部分(fēn)
1. 原代細胞分(fēn)離(lí)與培養............................................................................................ 2
1.1原代細胞分(fēn)離(lí)......................................................................................................... 2
1.2原代細胞培養......................................................................................................... 2
2. 幹細胞分(fēn)離(lí)培養...................................................................................................... 3
2.1胚胎幹細胞誘導分(fēn)化............................................................................................. 3
2.2腫瘤幹細胞（CSC）分(fēn)離(lí)鑒定............................................................................ 3
3. 細胞增殖相關研究方法.......................................................................................... 5
3.1 MTT分(fēn)析法............................................................................................................. 5
3.2 XTT........................................................................................................................... 5
3.3 WST-1...................................................................................................................... 6
3.4 CCK-8(WST-8)...................................................................................................... 6
3.4 平闆克隆形成........................................................................................................ 6
3.5 軟瓊脂克隆形成.................................................................................................... 7
3.6 BrdU........................................................................................................................ 7
4. 細胞轉移相關研究方法........................................................................................ 8
4.1 劃痕........................................................................................................................ 8
4.2 細胞粘附................................................................................................................ 8
4.3 Transwell遷移...................................................................................................... 9
4.4 Transwell侵襲...................................................................................................... 9
5. 血管生(shēng)成................................................................................................................ 10
6. 細胞周期：PI染色............................................................................................... 10
7. 細胞凋亡檢測........................................................................................................ 10
7.1 AnnexinV/PI雙染色法...................................................................................... 10
7.2 TUNEL法.............................................................................................................. 11
7.3 線粒體(tǐ)膜電(diàn)位(MMP)檢測................................................................................. 12
8. 細胞分(fēn)選.............................................................................................................. 12
8.1 流式分(fēn)選............................................................................................................. 12
8.2 磁珠珠分(fēn)選......................................................................................................... 13
9. 細胞轉染.............................................................................................................. 13
10. 細胞慢(màn)病毒感染................................................................................................. 14
11. 基因穩定細胞株的篩選..................................................................................... 14
12. 耐藥細胞株的篩選............................................................................................. 15
13. 細胞共培養......................................................................................................... 15
13.1直接共培養........................................................................................................ 15
13.2間接共培養........................................................................................................ 15
人或動物(wù)體(tǐ)内（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體(tǐ)外(wài)培養中(zhōng)生(shēng)長繁殖，必須将現有的組織塊充分(fēn)散開(kāi)，使細胞解離(lí)出來。
第一(yī)，懸浮細胞的分(fēn)離(lí)方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離(lí)心10 min。經離(lí)心後由于各種細胞的比重不同可在分(fēn)層液中(zhōng)形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。
第二，實體(tǐ)組織材料的分(fēn)離(lí)方法
對于實體(tǐ)組織材料，由于細胞間結合緊密，爲了使組織中(zhōng)的細胞充分(fēn)分(fēn)散，形成細胞懸液，可采用機械分(fēn)散法（物(wù)理裂解）和消化分(fēn)離(lí)法。其中(zhōng)，機械分(fēn)散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大(dà)，而且細胞分(fēn)散效果差，适用于處理纖維成分(fēn)少的軟組織。而消化分(fēn)離(lí)法是指把組織剪切成較小(xiǎo)團塊（或糊狀），應用酶的生(shēng)化作用和非酶的化學作用進一(yī)步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分(fēn)散或電(diàn)磁攪拌或在搖珠瓶中(zhōng)振蕩，使細胞團塊得以較充分(fēn)的分(fēn)散，制成少量細胞群團和大(dà)量單個細胞的細胞懸液，接種培養後，細胞容易貼壁生(shēng)長。
原代細胞的培養也叫初代培養，是從供體(tǐ)取得組織細胞在體(tǐ)外(wài)進行的首次培養，是建立細胞系的第一(yī)步。
第一(yī)，組織塊培養法
組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。其基本方法是将剪成的小(xiǎo)組織團塊接種于培養瓶（或皿）中(zhōng)，瓶壁可預先塗以膠原薄層，以利于組織塊粘着于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外(wài)生(shēng)長。
第二，消化培養法
第三，懸浮細胞培養法。
對于懸浮生(shēng)長的細胞，如白(bái)血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中(zhōng)的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離(lí)心分(fēn)離(lí)，直接培養，或經淋巴細胞分(fēn)層液分(fēn)離(lí)後接種培養。
第四，器官培養。
器官培養是指從供體(tǐ)取得器官或組織塊後，不進行組織分(fēn)離(lí)而直接在體(tǐ)外(wài)的特定環境條件下(xià)培養。器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯系、排列情況和相互影響，以及局部環境的生(shēng)物(wù)調節作用。
首先将類胚體(tǐ)消化成單細胞，貼壁培養，于不同的培養階段添加不同種類和不同濃度的化學物(wù)質、條件培養基或細胞因子等誘導條件，直接促進ES細胞定向分(fēn)化爲某種特殊類型的細胞；或通過改變培養條件對某些類型的細胞分(fēn)化起抑制作用，從而高效誘導目的細胞的分(fēn)化。改變細胞的培養條件使ES細胞進行定向分(fēn)化的基本策略有三種：一(yī)是向培養基中(zhōng)添加生(shēng)長因子和化學誘導劑等；二是将ES細胞與其它細胞一(yī)起進行培養；三是将細胞接種在适當的底物(wù)上，以促使細胞中(zhōng)某些特定基因的表達上調或下(xià)降，從而引發細胞沿着某一(yī)特定譜系進行分(fēn)化。
體(tǐ)外(wài)誘導胚胎幹細胞的物(wù)質有化學試劑誘導法、細胞因子誘導法和外(wài)源基因誘導法。
化學試劑誘導法：維甲酸（RA）、DMSO、β-磷酸甘油、維生(shēng)素C(VC)、地塞米松、維生(shēng)素K3(VK3)以及2，5-羟基維生(shēng)素D3等化學試劑，都能誘導ES細胞定向分(fēn)化爲特定類型細胞。
細胞因子誘導法：ES細胞在培養過程中(zhōng)對許多細胞因子具有很強的依賴性。增加或減少一(yī)種或幾種細胞因子可影響ES細胞的增殖或分(fēn)化。目前研究最深入的細胞因子主要有骨形成蛋白(bái)(BMPs)和成纖維細胞生(shēng)長因子(FGF)等。
外(wài)源基因誘導法：轉基因法可以彌補細胞因子法的不足。其原理是使某個促分(fēn)化基因在ES細胞中(zhōng)過度表達，從而調控ES細胞的分(fēn)化。應用此方法之前，首先要确定決定該細胞向不同方向分(fēn)化的關鍵基因，其次還要确保在适宜的時間将此基因正确插入到ES細胞基因組序列上。
對于CSC的分(fēn)離(lí)純化主要有根據細胞表型特征和生(shēng)物(wù)學特性而建立的兩大(dà)類方法 ：
第一(yī)類：依賴于細胞表面标志(zhì)的分(fēn)離(lí)方法
造血系統腫瘤幹細胞：正常造血幹細胞的表型爲CD34+CD38+Thy-1-
實體(tǐ)瘤腫瘤幹細胞：
A. 乳腺癌：ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的細胞是乳腺癌CSC。
B. 腦腫瘤：将CD133+的腫瘤細胞命名爲腦腫瘤幹細胞(BTSC), 還表達Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸絲氨酸磷酸化酶等神經幹細胞和其它幹細胞的基因特征
C. 結直腸癌：CD133+細胞是結直腸癌細胞的起始細胞。上皮細胞黏附分(fēn)子、CD44、CD166可以作爲鑒定結直腸癌幹細胞的細胞表面标志(zhì)。
以乳腺癌爲例，介紹實驗方法（其他腫瘤針對下(xià)面藍(lán)色的關鍵詞更改）：
人乳腺腫瘤細胞分(fēn)離(lí)培養：選擇XXX醫院腫瘤外(wài)科接受治療的乳腺癌患者，經過患者及其家屬知(zhī)情同意，在手術室無菌條件下(xià)獲取腫瘤組織樣本約10g，置無菌組織轉移液中(zhōng)，迅速轉入無菌實驗室内，PBS漂洗數遍，去(qù)除脂肪及壞死部分(fēn)，将乳腺組織充分(fēn)剪碎；将上述乳腺腫瘤組織移入離(lí)心管，加入8mL組織消化液（含2700U/mLⅣ型膠原酶1mL、0.02mg/mL透明質酸酶100μL、DNase50μL的DMEM培養液），輕輕混勻，37℃水浴消化1~2小(xiǎo)時，期間每20~30min振搖離(lí)心管1次，以便充分(fēn)消化；消化結束後，加入10mL PBS，搖勻後以1000r/min離(lí)心4min，棄上清，加入1mL乳腺腫瘤幹細胞培養液（含10mL/L FBS，100U/mL青黴素，100mg/mL鏈黴素，10ng/mL bFGF，20ng/mL EGF，20ng/mL ITS的DMEM-F12培養液），混勻，1000r/min離(lí)心4min，棄上清；以1×106/mL細胞密度接種于細胞培養瓶中(zhōng)，置入37℃、50mL/L CO2培養箱中(zhōng)培養。3d後換液，約7~10d開(kāi)始出現懸浮生(shēng)長的細胞克隆球。
流式細胞術檢測獲得乳腺腫瘤細胞：收集培養的乳腺腫瘤細胞克隆球，離(lí)心并棄去(qù)培養基；PBS漂洗1遍，Accutase消化2min後加等體(tǐ)積培養基終止消化；将細胞懸液移入15mL離(lí)心管1000r/min離(lí)心4min，棄上清，用PBS溶液混懸後無菌濾膜過濾，取4支試管，按如下(xià)組合順序分(fēn)别加入熒光标記抗體(tǐ)各10μL：IgG1-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/IgG1-PE，CD24-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/CD24-PE，再加入500μL細胞懸液入試管中(zhōng)，混勻，室溫避光靜置15min，流式細胞儀檢測。
第二類 根據幹細胞外(wài)排DNA結合熒光染料Hoechst33342而建立的SP細胞分(fēn)離(lí)法
在Hoechst33342染色的骨髓細胞中(zhōng)存在着一(yī)群染色很淺的細胞群，通過紫外(wài)激發後 用雙波長分(fēn)别爲450nm的藍(lán)色熒光~675nm的紅色熒光分(fēn)析，其中(zhōng)有不到0.1％的細胞發 出微弱的藍(lán)光和紅光，在流式二維分(fēn)析點陣圖上，呈彗星狀分(fēn)布在造血幹/祖細胞主群的一(yī)側 ，因此被稱爲側群(SP)細胞。SP細胞廣泛存在于人和動物(wù) 的多種成體(tǐ)組織 、實體(tǐ)瘤及腫瘤細胞系中(zhōng)，并具有幹細胞樣特征。
實驗方法：
① 細胞染色： 細胞消化計數，用37℃預熱的DF12培養基重懸，調整到1×106/mL濃度，制備成單細胞懸液；加入熒光染料Hoechst33342，使終濃度爲6 μg/mL，37℃避光水浴90 min；冰上10 min終止染色，計數細胞；離(lí)心細胞後，用冰預冷DF12洗滌細胞并重懸浮，将分(fēn)選組調整濃度到1×107/mL以上，必要時加入1倍的DNase I；上機前再加入PI使終濃度爲2 μg/mL以區分(fēn)死細胞，并且400濾網過濾細胞。② 流式細胞儀檢測：355 nm UV激發光源，610 nm雙色短通反射濾鏡，450 nm和675 nm邊緣長通濾片分(fēn)别檢測散射光藍(lán)光及紅光部分(fēn)，線性模式采集信号. 測量前向散射和側向散射二維參數圖，檢測細胞均一(yī)性，以Hoechst Red爲X軸，Hoechst Blue爲Y軸作二維散點圖，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且維拉帕米組缺失的區域設定爲SP細胞的“門”（gate），計算百分(fēn)比，分(fēn)選出SP細胞及Non SP細胞。
MTT爲黃色化合物(wù)，是一(yī)種接受氫離(lí)子的染料，可作用于活細胞線粒體(tǐ)中(zhōng)的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下(xià)tetrazolium環開(kāi)裂，生(shēng)成藍(lán)色的formazan結晶，formazan結晶的生(shēng)成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中(zhōng)琥珀酸脫氫酶消失，不能将MTT還原）。
實驗方法：
接種XXX細胞用含10%胎小(xiǎo)牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔闆，每孔體(tǐ)積200 μL。培養細胞同一(yī)般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。呈色培養3－5天後，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配）20 μL。繼續孵育4小(xiǎo)時，終止培養，小(xiǎo)心吸棄孔内培養上清液，對于懸浮細胞需要離(lí)心後再吸棄孔内培養上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物(wù)充分(fēn)融解。比色選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間爲橫坐标，吸光值爲縱坐标繪制細胞生(shēng)長曲線。
XTT是一(yī)種與MTT類似的四唑氮衍生(shēng)物(wù)，可被活細胞線粒體(tǐ)脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷産物(wù)，當XTT與電(diàn)子偶合劑共同使用時，甲肷的生(shēng)成量與細胞的增殖程度呈正相關。
實驗方法：
首先配置6.6 mmol/L XTT溶液和220 mmol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)溶液。臨用時将XTT與PMS按1：1混合，形成XTT/PMS。接種XXX細胞：用含10%胎小(xiǎo)牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔闆，每孔體(tǐ)積200 μL。培養細胞：同一(yī)般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。于終止培養前2 h，每孔加入XTT/PMS 20μL，混勻後再培養2 h。在酶标儀上450 nm處測定光吸光度，參考波長爲655nm。
此法是用于測定細胞增殖或毒性試驗中(zhōng)活細胞數目的一(yī)種高靈敏度、高穩定性且無放(fàng)射性的比色檢測法。實驗的靈敏度比其它四唑鹽如MTT，XTT，MTS高，線性範圍更寬。
實驗方法：
在96孔闆加入XXX細胞100 μL/孔（約1×104），置37℃ 5% CO2細胞培養箱培養24小(xiǎo)時。加入适當濃度的受試化合物(wù)。将96孔闆在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中(zhōng)孵育适當時間。采用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，向各孔中(zhōng)加入10 μL的四唑鹽工(gōng)作液。37℃下(xià)孵育1～4小(xiǎo)時。酶标儀在450nm波長處檢測每孔的光密度。
CCK-8是近年新開(kāi)發的一(yī)種更新的水溶性四唑鹽檢測，原理與WST-1類似：在電(diàn)子載體(tǐ)1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽（1-Methoxy PMS）的作用下(xià)被細胞線粒體(tǐ)中(zhōng)的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色甲臜産物(wù)（Formazan）。生(shēng)成的甲臜物(wù)的數量與活細胞的數量成正比，用酶聯免疫分(fēn)析儀測定其光吸收值可間接反映活細胞數量，在一(yī)定細胞數量範圍内甲臜形成的量與細胞數成正比。
實驗方法：
在96孔闆中(zhōng)接種細胞懸液（100 μL/孔）。将培養闆放(fàng)在培養箱中(zhōng)預培養（37℃,5% CO2）。細胞經處理後。向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中(zhōng)生(shēng)成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。将培養闆在培養箱内孵育1～4小(xiǎo)時。用酶标儀測定在450nm處的吸光度。若暫時不測定OD值，可以向每孔中(zhōng)加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養闆避光保存在室溫條件下(xià)。24小(xiǎo)時内測定，吸光度不會發生(shēng)變化。
平闆克隆形成試驗方法簡單，适用于貼壁生(shēng)長的細胞。适宜底物(wù)爲玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一(yī)定要分(fēn)散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大(dà)。
實驗方法：
取對數生(shēng)長期的單層培養的XXX細胞，用0.25%胰蛋白(bái)酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中(zhōng)備用。将細胞懸液作梯度倍數稀釋，以适當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中(zhōng)。一(yī)般分(fēn)每皿50、100、200個細胞的梯度密度分(fēn)别接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中(zhōng)，并輕輕轉動，使細胞分(fēn)散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環境下(xià)，靜置培養2～3周。當培養皿中(zhōng)出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去(qù)上清液，用PBS小(xiǎo)心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15min。然後去(qù)固定液，加适量Giemsa應用染色液染10～30min，然後用流水緩慢(màn)洗去(qù)染色液，空氣幹燥。将平皿倒置并疊加一(yī)張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大(dà)于50個細胞的克隆數。最後計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中(zhōng)瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一(yī)般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀态下(xià)不能增殖，不适用于軟瓊脂克隆形成試驗。
實驗方法：
取對數生(shēng)長期XXX細胞，用0.25%胰蛋白(bái)酶消化并輕輕吹打，使之成爲單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然後根據實驗要求作梯度倍數稀釋。用蒸餾水分(fēn)别制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌後，維持在40℃中(zhōng)不會凝固。按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生(shēng)素和20%的小(xiǎo)牛血清)混合後，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(zhōng)(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中(zhōng)備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中(zhōng)相混以後，再向管中(zhōng)加入0.2mL的細胞懸液，充分(fēn)混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中(zhōng)，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固後，置入37℃5%CO2溫箱中(zhōng)培養10～14天。把平皿放(fàng)置在倒置顯微鏡下(xià)，觀察細胞克隆數。計算形成率。
BrdU是胸腺嘧啶的衍生(shēng)物(wù)，常用于标記活細胞中(zhōng)新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到複制細胞中(zhōng)新合成的DNA中(zhōng)（細胞周期S期）。這種摻入可以穩定存在，随着DNA複制進入子細胞中(zhōng)。BrdU特異性抗體(tǐ)可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。
實驗方法：
将細胞密度爲1.5×105/mL的XXX細胞接種于直徑35 mm培養皿中(zhōng)（内放(fàng)置一(yī)蓋玻片），培養1天，用含0.4％FBS培養液同步化3天，使絕大(dà)多數細胞處于G0期。加入BrdU（儲液：1.0mg/mL，終濃度爲0.03μg/mL），37℃，孵育40min。棄培養液，玻片用PBS洗滌3次。甲醇/醋酸固定10min。經固定的玻片空氣幹燥，0.3%H2O2-甲醇30min滅活内源性氧化酶。5%正常兔血清封閉。甲酰胺100℃，5min變性核酸。冰浴冷卻後PBS洗滌，加1抗即抗小(xiǎo)鼠BrdU單抗（工(gōng)作濃度1：50），陰性對照加PBS或血清。按免疫組織化學常用的檢測方法ABC法進行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下(xià)随機計數10個高倍視野中(zhōng)細胞總數及BrdU陽性細胞數，計算标記指數LI。
腫瘤細胞在體(tǐ)外(wài)仍具有遷移的能力，本實驗借鑒體(tǐ)外(wài)細胞緻傷愈合實驗模型，利用細胞劃痕法測定了腫瘤細胞的運動特性。
實驗方法：
将細胞密度爲5~10×105個/mL的XXX細胞鋪于24孔闆（每孔500 μL）上，加入含10%胎牛血清的RMPI.1640培養液，培養16~24h，使形成單層細胞。用10μL移液槍槍頭（或者無菌牙簽）在單層細胞上呈“一(yī)”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24h後換成含10%胎牛血清的RMPI.1640培養液，孵育24h。觀察并拍照：吸去(qù)培養液，用PBS清洗3次後，在倒置熒光顯微鏡下(xià)觀察并拍照。
細胞粘附實驗通常分(fēn)爲兩類，即細胞與細胞粘附和細胞與基質粘附。機體(tǐ)内許多細胞，如上皮細胞固定在某處發揮功能；另一(yī)些細胞，如白(bái)細胞，活躍運動，就需要不斷調節細胞粘附。細胞粘附性的改變在腫瘤轉移過程中(zhōng)也發揮着重要作用。惡性腫瘤具有從原發瘤分(fēn)離(lí)及在體(tǐ)内擴散的能力，提示這些細胞相互識别及粘附機制發生(shēng)了改變。
實驗方法：
用10 μg/mL的纖連蛋白(bái)(fibronectin,FN)預鋪96孔闆，70 μL/孔，4℃過夜後，PBS洗3遍，再用1% BSA于37℃封閉1h，PBS洗3遍。将待測XXX細胞培養至對數生(shēng)長期，消化細胞，用無血清培養基懸浮細胞，調整濃度爲5×105/mL分(fēn)别接種于預鋪FN的96孔闆中(zhōng)，每孔5000個細胞，每組設3個複孔。37℃孵育1h後，PBS洗去(qù)未黏附的細胞。
檢測方法1：
3.5%戊二醛于4℃固定0.5h，PBS洗3遍；0.1%的結晶紫染色，室溫靜止0.5h，PBS洗3遍，每孔加入100 μL 10%的乙酸，5~10min後用酶标儀檢測595nm的吸光度值，用以表示黏附細胞的多少。
檢測方法2：按照每孔加入100μL甲醇，固定15 min每孔加入100 μL吉姆薩染液，染色15min，PBS洗去(qù)染液倒置顯微鏡下(xià)随機取5個随機視野計數粘附細胞數量病拍照，統計結果。
檢測方法3：MTT法或CCK-8檢測細胞量。
細胞遷移實驗将Transwell小(xiǎo)室放(fàng)入培養闆中(zhōng)，小(xiǎo)室内稱上室，培養闆内稱下(xià)室，上下(xià)層培養液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的XXX細胞種在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下(xià)層培養液中(zhōng)的成分(fēn)可以影響到上室内的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。
實驗方法：
所有細胞培養試劑和Transwellchamber放(fàng)在37℃溫育。待測XXX細胞培養至對數生(shēng)長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先後洗滌一(yī)次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度爲2×105/mL。在下(xià)室（即24孔闆底部）加入600－800μL含10%血清的培養基，上室加入100－150μL細胞懸液，繼續在孵箱培養24小(xiǎo)時。用鑷子小(xiǎo)心取出chamber，吸幹上室液體(tǐ)，移到預先加入約800μL甲醇的孔中(zhōng)，室溫固定30 min。取出chamber，吸幹上室固定液，移到預先加入約800μL Giemsa染液的孔中(zhōng)，室溫染色15－30 min。輕輕用清水沖洗浸泡數次，取出chamber，吸去(qù)上室液體(tǐ)，用濕棉棒小(xiǎo)心擦去(qù)上室底部膜表面上的細胞。用小(xiǎo)鑷子小(xiǎo)心揭下(xià)膜，底面朝上晾幹，移至載玻片上用中(zhōng)性樹(shù)膠封片。顯微鏡下(xià)取9個随機視野計數，統計結果。
所謂Transwell侵襲實驗，其實是指将Transwell這一(yī)技術應用于腫瘤細胞侵襲研究的一(yī)種實驗。
實驗方法：
基質膠準備：将凍存于－80℃冰箱的BD matrigel 4℃過夜（24h），變成液态。取300μL無血清培養基，加入60μL（或50μg/每室）Matrigel，4℃混勻，加入上室各100μL（3個室），放(fàng)入37℃培養箱中(zhōng)，孵育4-5h。當出現“白(bái)色層”時，說明已經變爲固态。消化XXX細胞，無血清培養基洗3次，計數，配成細胞懸液。用無血清培養基洗Matrigel洗1次，每孔加入100μL細胞懸液。下(xià)腔室中(zhōng)加入500μL含有20%FBS條件培養基。37℃培養箱中(zhōng)，孵育20-24h。取出transwell用PBS洗2次，5%戊二醛4℃固定。加入0.1%結晶紫染色或Giemsa染色，室溫染色5－10min，0.5h，PBS洗2次，用棉球擦去(qù)上表面細胞，顯微鏡下(xià)取9個随機視野計數，統計結果。
腫瘤血管生(shēng)成是一(yī)個極其複雜(zá)的過程，一(yī)般包括包括血管内皮基質降解、内皮細胞移行、内皮細胞增殖、内皮細胞管道化分(fēn)支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。由于腫瘤組織這種新生(shēng)血管結構及功能異常，且血管基質不完善，這種微血管容易發生(shēng)滲漏，因此腫瘤細胞不需經過複雜(zá)的侵襲過程而直接穿透到血管内進入血流并在遠隔部位形成轉移。
實驗方法：
将原濃度的matrigel膠（10mg/mL）置于4℃冰箱中(zhōng)過夜，使其成爲膠凍狀。将膠凍狀的matrigel膠鋪入24孔闆的孔中(zhōng)，每孔40μL，使其成爲一(yī)小(xiǎo)丘的形狀，然後置于37℃孵箱中(zhōng)2h使其固化。将細胞消化計數，将某一(yī)密度的XXX細胞懸液滴加至matrigel膠的表面置于37℃孵箱繼續培養，每孔1mL，每組三個複孔。于100－400倍相差顯微鏡下(xià)，12，24，48，72，96h後，後取出細胞培養闆，拍照，Image-Pro Plus圖像分(fēn)析軟件計數每孔的管腔形成個數。
熒光染料PI（碘化丙啶）是一(yī)種可對DNA染色的細胞核染色試劑，常用于細胞凋亡檢測，英文全稱是PropidiumIodide。它是一(yī)種溴化乙啶的類似物(wù)，在嵌入雙鏈DNA後釋放(fàng)紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。PI經常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一(yī)起使用，能同時對活細胞和死細胞染色。PI-DNA複合物(wù)的激發和發射波長分(fēn)别爲535nm和615nm。
實驗方法：
取生(shēng)長期的XXX細胞，加入3mL PBS，去(qù)掉液體(tǐ)加入1mL胰蛋白(bái)酶消化1~5min。加入5mL PBS制成細胞懸液，移至15mL離(lí)心管中(zhōng)1500rpm離(lí)心5min，去(qù)上清液。加入500μL PBS輕輕吹打細胞團成細胞懸液，在旋渦狀态下(xià)逐滴加入2 mL 20℃ 95%冷乙醇，混勻後固定30 min。加入5mL PBS，1500 rpm離(lí)心5min，去(qù)上清液。加入5mL PBS重懸細胞，1500rpm離(lí)心5min，去(qù)上清液。加入800μL PI染液，用槍輕輕吹打細胞團，混勻，室溫避光染色30min。用流式細胞儀上機檢測。
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的内側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的内側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外(wài)環境中(zhōng)。AnnexinV是一(yī)種分(fēn)子量爲35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白(bái)，能與PS高親和力特異性結合。将AnnexinV進行熒光素（FITC、PE）或Biotin标記，以标記了的AnnexinV作爲熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生(shēng)。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一(yī)種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中(zhōng)晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此将AnnexinV與PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分(fēn)開(kāi)來。
實驗方法：
XXX細胞直接收集到10mL的離(lí)心管中(zhōng)，每樣本細胞數爲（1~5）×106/mL， 1000r/min離(lí)心5min，棄去(qù)培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000r/min離(lí)心5min。用100μL的标記溶液重懸細胞，室溫下(xià)避光孵育10~15min。1000r/min離(lí)心5min沉澱細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下(xià)孵育20min，避光并不時振動。流式細胞儀激發光波長用488nm，用一(yī)波長爲515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一(yī)波長大(dà)于560nm的濾器檢測PI。
結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI着染産生(shēng)紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光産生(shēng)。因此，在細胞凋亡的早期PI不會着染而沒有紅色熒光信号。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下(xià)象限顯示活細胞，爲（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，爲（FITC+/PI+）；而右下(xià)象限爲凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。
TUNEL法也稱DNA斷裂的原位末端标記法，這一(yī)方法能對DNA分(fēn)子斷裂缺口中(zhōng)的3’-OH進行原位标記，借助一(yī)種可觀測的标記物(wù)，如熒光素，能對凋亡細胞的核DNA中(zhōng)産生(shēng)的3’-OH末端進行原位标記，用熒光顯微鏡即可進行觀察。
實驗方法：
固定 → 透膜 → 加TUNEL反應混合物(wù) → 加轉化劑－POD → 加底物(wù)溶液 → 觀察結果
經過實驗處理的細胞爬片或者細胞塗片，自然晾幹，室溫固定15-30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，加封閉液，室溫孵育10 min。PBS漂洗後加透膜液，室溫孵育30min。制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μL TdT＋450μL熒光素标記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μL熒光素标記的dUTP液，陽性對照組先加入100μL DNase1，反應在室溫～37℃×10～30min，後面步驟同處理組。玻片幹後，加50μL TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μL熒光素标記的dUTP液）于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中(zhōng)反應37℃×60min。PBS漂洗3次。可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下(xià)計數凋亡細胞（激發光波長爲450～500nm，檢測波長爲515～565nm）。玻片幹後加50μl converter-POD于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中(zhōng)反應37℃×30min。PBS漂洗3次。在組織處加50～100μL DAB底物(wù)，反應15～25℃×10min。PBS漂洗3次。拍照後再用蘇木素或甲基綠複染，幾秒後立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中(zhōng)性樹(shù)膠封片。加一(yī)滴PBS或甘油在視野下(xià)，用光學顯微鏡進行計數（200～500個細胞）并拍照。
JC-1是一(yī)種碳氰化合物(wù)類陽離(lí)子熒光染料，可作爲檢測線粒體(tǐ)跨膜電(diàn)位指示劑。JC-1在細胞内以聚合體(tǐ)和單體(tǐ)兩種不同的物(wù)理形式存在，分(fēn)别處于不同的熒光發射峰。當JC-1濃度低或膜電(diàn)位水平低時，主要以單體(tǐ)形式存在，激發波長爲527nm，呈綠色熒光；當JC-1濃度升高或線粒體(tǐ)膜電(diàn)位水平較高時，形成聚合物(wù)，發出紅色的熒光，激發波長爲590nm。當細胞發生(shēng)凋亡時，線粒體(tǐ)跨膜電(diàn)位被去(qù)極化，JC-1從線粒體(tǐ)内釋放(fàng)，紅光強度減弱，以單體(tǐ)的形式存在于胞質内發綠色熒光，根椐這一(yī)特征就可以檢測線粒體(tǐ)膜電(diàn)位的變化。
實驗方法：
用适當的方法誘導XXX細胞凋亡，收集細胞。用PBS洗滌細胞三次，收集不多于1×106的細胞。取100μL 10×IncubationBuffer加900μL滅菌去(qù)離(lí)子水稀釋成1×IncubationBuffer，混勻并預熱至37℃。吸取500μL1×IncubationBuffer，加入1μLJC-1，渦旋混勻配成JC-1工(gōng)作液。取500μLJC-1工(gōng)作液将細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養箱中(zhōng)孵育15~20min。室溫離(lí)心（2000rpm，5min）收集細胞，用1×IncubationBuffer洗兩次。吸取500μL10×IncubationBuffer重新懸浮細胞。流式細胞儀檢測，分(fēn)析。
流式細胞分(fēn)選技術是利用流式細胞分(fēn)選儀，以高能量激光照射高速流動狀态下(xià)被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其産生(shēng)的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物(wù)理、生(shēng)理、生(shēng)化、免疫、遺傳、分(fēn)子生(shēng)物(wù)學性狀及功能狀态等進行定性或定量檢測的一(yī)種現代細胞分(fēn)析技術，它可根據發射光的熒光強度和波長将發光顆粒亞群分(fēn)開(kāi)并可實現單克隆分(fēn)選，能複雜(zá)樣本中(zhōng)的細胞進行鑒定、分(fēn)類、定量和分(fēn)離(lí)，單次可同時對其中(zhōng)一(yī)種到四種特定細胞進行超高速分(fēn)選純化、高通量單克隆分(fēn)選或細胞芯片制備。
實驗方法：
分(fēn)選前先做預實驗，優化流式細胞儀的測定條件，建立分(fēn)選門，具體(tǐ)操作步驟見Cellquest操作步驟說明。根據XXX細胞的含量，調整流速和樣品濃度，使XXX細胞通過樣品室的濃度爲100-300個/秒，最好在200左右。進入CellQuest，從Aquire菜單連機。打開(kāi)CellQuest中(zhōng)存儲的獲取窗口，打開(kāi)優化後存儲的儀器設置條件。進樣針處放(fàng)上樣本管。從Acquiremenu選擇SortSetup。依據樣本中(zhōng)XXX細胞的百分(fēn)比及實驗目的決定分(fēn)選模式：在SortGate中(zhōng)選擇分(fēn)選用的門，如選擇NoGate（所有細胞）将隻進行獲取不分(fēn)選；在SortCount-中(zhōng)選擇0進行連續分(fēn)選；在SortMode中(zhōng)選擇SingleCell、Recovery、Exclusion的某種模式；在AbortedCell中(zhōng)選擇不顯示排除細胞數。點OK。點擊液流控制鍵RUN。點擊獲取控制窗口Aquire。分(fēn)選結束時點擊Pause，Abort。取下(xià)樣本管，換上1mL蒸餾水。點擊獲取控制窗口Standby。取下(xià)收集錐型管。離(lí)心濃縮（300g, 5min），用培養液重懸XXX細胞，按實驗所需條件進行培養。
免疫磁珠法分(fēn)離(lí)細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外(wài)加磁場中(zhōng)，通過抗體(tǐ)與磁珠相連的細胞被吸附而滞留在磁場中(zhōng)，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接着磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中(zhōng)停留，從而使細胞得以分(fēn)離(lí)。
實驗方法：
離(lí)心收集待分(fēn)離(lí)XXX細胞，用少量PBE孵育液（0.5%BSA、0.08%EDTAPH7.2PBS，真空抽濾除菌及液體(tǐ)内氣體(tǐ)）充分(fēn)混懸細胞（0.5mL/1×108細胞），加入一(yī)抗（10~20μg/mL終濃度），4°C孵育30 min。用20倍體(tǐ)積PBE洗細胞一(yī)次，再加PBE（0.3mL/1×108細胞）充分(fēn)混懸細胞後，加入相應二抗包被的超微磁珠，混勻後置8~15°C孵育10~15 min。将分(fēn)離(lí)柱安裝入磁場中(zhōng)，加入0.5mLPBE，在重力作用下(xià)自然流盡，以預處理分(fēn)離(lí)柱。将孵育完畢的細胞懸液加到分(fēn)離(lí)柱中(zhōng)，自然流盡。以0.5mL PBE加入分(fēn)離(lí)柱中(zhōng)，自然流盡，洗柱二次。從磁場中(zhōng)取下(xià)分(fēn)離(lí)柱，插在試管口上，加入1~2mLPBE，用針芯用力推盡液體(tǐ)，沖出陽性結合的細胞。用培養基洗一(yī)次，待用。
細胞轉染是指将外(wài)源分(fēn)子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。用于研究基因功能、調控基因表達、突變分(fēn)析和蛋白(bái)質生(shēng)産等生(shēng)物(wù)學試驗中(zhōng)。
實驗方法：
轉染試劑的準備：将400μL去(qù)核酸酶水加入管中(zhōng)，震蕩10秒鍾，溶解脂狀物(wù)。震蕩後将試劑放(fàng)在－20℃保存，使用前還需震蕩。選擇合适的混合比例(1：1－1：2/脂質體(tǐ)體(tǐ)積：DNA質量)來轉染細胞。在一(yī)個轉染管中(zhōng)加入合适體(tǐ)積的無血清培養基。加入合适質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩後在加入合适體(tǐ)積的轉染試劑，再次震蕩。将混合液在室溫放(fàng)置10―15 min。吸去(qù)培養闆中(zhōng)的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一(yī)次。加入混合液，将XXX細胞放(fàng)回培養箱中(zhōng)培養一(yī)個小(xiǎo)時。到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小(xiǎo)時。
慢(màn)病毒源于反轉錄病毒，但又(yòu)有所不同。在感染能力方面比反轉錄病毒還強，可有效感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、幹細胞等多中(zhōng)類型的細胞，又(yòu)很少引發基因的免疫反應。
實驗方法：
在大(dà)規模的感染之前，優化以下(xià)參數：細胞種植密度，慢(màn)病毒的數量，嘌呤黴素的濃度，感染時間，以确定一(yī)個實驗的最适條件。在6cm培養皿中(zhōng)種植适當密度的XXX細胞，每孔體(tǐ)積6mL。貼壁細胞：轉染前1天種植XXX細胞。懸浮細胞：轉染當天種植XXX細胞，培養基中(zhōng)需要含有凝聚胺。XXX細胞中(zhōng)加入病毒：貼壁細胞，棄掉培養基，加入新鮮的含有凝聚胺的培養基。或者，棄掉部分(fēn)培養基并且補充含有凝聚胺的培養基。調整體(tǐ)積和凝聚胺的濃度，使得凝聚胺的終濃度爲8μg/mL。病毒感染：孵育細胞過夜。感染後24h更換培養基。棄掉培養基，換入6mL新鮮的培養基。如果需要抗生(shēng)素選擇，則使用含有抗生(shēng)素的新鮮培養基。注意：嘌呤黴素的濃度根據每種細胞系來進行優化；常用的濃度範圍爲2-5μg/mL。孵育細胞，根據需要每隔幾天更換培養基（如果需要，則要含有抗生(shēng)素）。孵育時間的長短主要依賴于感染後的試驗。
外(wài)源基因在細胞中(zhōng)的表達可分(fēn)爲兩大(dà)類，一(yī)類是瞬時表達，一(yī)類是穩定表達（又(yòu)叫永久表達）。前者外(wài)源DNA/RNA不整合到宿主染色體(tǐ)中(zhōng)，雖然可以達到高水平的表達，但通常隻持續幾天。後者外(wài)源DNA整合到宿主細胞染色體(tǐ)上，使宿主細胞可長期表達目的基因。建立穩定細胞株，一(yī)般是根據不同基因載體(tǐ)中(zhōng)所含有的抗性标志(zhì)選用相應的藥物(wù)對靶細胞進行篩選。最常用的抗性标記基因有潮黴素（hygromycin）、新黴素（neomycin）和嘌呤黴素（puromycin）。
實驗方法：
G418（Geneticin,遺傳黴素）是一(yī)種氨基糖苷類抗生(shēng)素 ,在分(fēn)子遺傳試驗中(zhōng)，是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。以G418爲例：轉染目的基因+neo基因。G418對細胞最小(xiǎo)緻死量測定：将細胞傳至25mL培養瓶中(zhōng)每瓶加3mL細胞生(shēng)長液待細胞長滿，按下(xià)列濃度加G418：0、100、200、300、400、500、600、700μg/mL，繼續培養觀察細胞生(shēng)長及死亡情況，每天換液一(yī)次仍以上述濃度加G418，兩周内使細胞全部死亡的最小(xiǎo)濃度即爲最小(xiǎo)緻死量。抗性細胞的篩選：将轉染的細胞進行傳代同時換爲選擇性培養基(生(shēng)長培養液＋最小(xiǎo)緻死量濃度G418)繼續培養約2周，待對照細胞全部死亡時，已基本得到G418抗性細胞的穩定克隆。挑取單個細胞的克隆至24孔塑料培養闆繼續進行篩選擴增即爲G418抗性細胞。
一(yī)種是脂質體(tǐ)轉染後，單克隆篩選穩定細胞株。另外(wài)一(yī)種是應用逆轉錄病毒，慢(màn)病毒轉染，篩選穩定細胞株。
脂質體(tǐ)轉染：在轉染24小(xiǎo)時後，消化XXX細胞并計數。将細胞種到96孔闆，保證每個孔2-3個細胞，這樣才能得到單克隆。待細胞貼壁後，加入抗生(shēng)素篩選。篩選時間和濃度視細胞而定。一(yī)般G418（Geneticin,遺傳黴素）作用一(yī)個星期，嘌呤黴素作用2-3天。脂質體(tǐ)法篩單克隆時間較長，且效率低，大(dà)概隻有1%。
慢(màn)病毒轉染：先要用包裝細胞，一(yī)般爲293細胞，包裝出病毒，再用病毒轉染目的細胞。包裝病毒視不同類型的病毒而定，一(yī)般要3-5天的時間。包裝好的病毒要測滴度，根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。轉染目的細胞1-2天後加抗生(shēng)素篩選得到穩定細胞株。
共培養體(tǐ)系主要用于誘導細胞向另一(yī)種細胞分(fēn)化，誘導細胞自身分(fēn)化，維持細胞功能和活力，對細胞增殖進行調控，促進早期胚胎的發育和提高代謝産物(wù)的産量。
制備細胞懸液：分(fēn)别消化細胞A和細胞B，終止消化後離(lí)心棄去(qù)培養液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養基重懸，調整細胞密度。将兩種細胞按照一(yī)定比例在同一(yī)培養皿中(zhōng)共同培養。顯微鏡下(xià)觀察細胞形态變化和增殖情況。結果統計分(fēn)析。
将Transwell小(xiǎo)室放(fàng)入培養闆中(zhōng)，小(xiǎo)室内稱上室，培養闆内稱下(xià)室，上下(xià)層培養液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的細胞種在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下(xià)層培養液中(zhōng)的成分(fēn)可以影響到上室内的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。兩種細胞聯合培養，研究其中(zhōng)一(yī)種細胞分(fēn)泌的因子對另一(yī)細胞性能的影響，此時選擇小(xiǎo)于3.0μm孔徑，細胞不會遷移通過，将細胞A種于上室，細胞B種于下(xià)室，可以研究細胞B分(fēn)泌或代謝産生(shēng)的物(wù)質對細胞A的影響。間接共培養範例：
觀察在 Transwell小(xiǎo)室環境下(xià)成骨樣細胞與骨髓基質幹細胞體(tǐ)外(wài)共培養及成骨樣細胞定向誘導骨髓基質幹細胞向成骨細胞分(fēn)化的可行性。取乳兔成骨樣細胞與兔骨髓基質幹細胞接種共培養于Transwell小(xiǎo)室内,成骨樣細胞接種于培養闆底層,骨髓基質幹細胞接種于 Transwell膜内膜上作爲實驗組。以骨髓基質幹細胞單獨接種于Transwell 小(xiǎo)室内,下(xià)層爲基礎培養液作爲對照組。
微環DNA表達雙靶向抗體(tǐ)的癌症免疫治療技術成爲繼CAR-T技術(“嵌合抗原受體(tǐ)T細胞免疫療法”)、TIL技術(“腫瘤滲潤淋巴細胞技術)、免疫檢查點抑制劑等技術之後又(yòu)一(yī)項獲得成功的新一(yī)代治療技術。
